冷冻电镜是个啥它到底有多牛？什么原理(冷冻电镜的优缺点)

说到冷冻电子显微镜(Cryo-EM)，这项技术能获得诺贝尔奖并非偶然。然而，2017年诺贝尔化学奖公布后，有评论称，又一次与这个奖项的共同名称"诺贝尔科学技术奖"奖项背后的获奖者都有生物物理背景，目前影响最大的领域是生物学。

生命活动的关键密

码在于核酸和蛋白质。核酸因其携带遗传物质而备受科研界关注，而蛋白质作为生命活动的主要执行者兴起于20世纪60年代。x射线晶体成像和核磁共振是近80年来获得生物分子模型的两种主要方法。

x射线晶体学是最早用于结构分析的实验方法之一。其中一个关键步骤是培养纯化的生物样品，以获得用于X射线衍射的单晶。现实是目前很多复杂的大分子物质很难获得晶体。

核磁共振可以分析溶液中的蛋白质结构，因此被认为比晶体结构更能描述生物大分子在细胞中的真实结构，可以获得氢原子的结构位置。缺点是蛋白质在溶液中的结构往往不稳定，因此很难获得稳定的信号。

因此，无论是X射线晶体成像还是核磁共振都无法让研究人员获得高分辨率的大蛋白质复杂结构，生物结构领域的发展因此被成像技术所困。2013年成为分水岭的一年，冷冻电镜在这一年走向成熟。

冷冻电镜打开了一个长期停滞的局面。研究人员可以通过冷冻移动的生物分子，在不将大分子样品制成晶体的情况下，在原子水平上进行高分辨率成像。

随后，蛋白质或复杂蛋白质结构分析领域的多篇诺贝尔奖级论文相继发表，其背后的利器就是冷冻电镜，该技术的应用也正式迎来了井喷发展阶段。2015年，国际知名期刊《自然》的子公司NatureMethods将冷冻电子显微镜评为年度最受关注的技术。

中国科学院院士、结构生物学家、清华大学副校长、中国冷冻电镜应用领域的领军人物石今年5月表示，冷冻电镜的发展就像一场暴力革命。"就目前的发展前景来看，冷冻电镜是可以和测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术！"

这个正式叫"以诺贝尔奖的名义。让生物化学进入新时代"技术，其故事的源头要追溯到20世纪70年代的理查德·亨德森(Richard Henderson)，他坚定地将生物分子的观察引入了电子显微镜的道路。

x射线晶体学上限

出生于苏格兰，72岁的理查德·亨德森被认为是生物大分子高分辨率观测革命背后的发起人。

亨德森于1969年获得剑桥大学分子生物学实验室的X射线晶体学博士学位，此前曾在爱丁堡大学攻读物理学。博士毕业后在耶鲁大学做博士后研究，最终于1973年回到剑桥大学。他目前是剑桥大学MRC分子生物学实验室的主任。

起初，亨德森试图用传统的X射线结晶学对细胞膜中嵌入的蛋白质进行成像。然而，很难跨越晶体制备的基本障碍。一旦嵌入的蛋白质与细胞膜分离，结构就会迅速崩溃。经过几年毫无结果的研究，亨德森意识到X射线晶体学已经达到了蛋白质结构分析的上限，他不得不将注意力转向另一种成像技术。

亨德森迷茫的时候，冷冻显微镜的雏形刚刚建立。

1968年，同样是在剑桥大学MRC分子生物学实验室，AronKlug和他的学生DeRosier发表了利用电镜照片重建噬菌体病毒尾部三维结构的论文，提出并确立了电镜三维重建的一般概念和方法。阿伦克洛获得了1982年的诺贝尔化学奖。

1974年，美国加州大学伯克利分校的罗伯特·格莱泽和他的学生肯·泰勒首先提出了冷冻电子显微镜，并对冷冻含水生物样品的电子显微镜成像进行了试验，目的是减少高能电子对分子结构的破坏，从而实现高分辨率成像。

揭开生物分子的原子层面纱

1975年，距离电子显微镜的诞生及其在"死亡"物质如火如荼，但一般认为是生物学领域"不适用"。强电子束，真空腔，这些环境让生物样本注定毁灭。

然而，亨德森对细菌视紫红质(bR)的尝试证明了电子显微镜在生物领域的适用性。

亨德森将没有离开细胞膜的细菌视紫红质直接放在电子显微镜下观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止true 空干涸，并采用较低强度的电子束电流，得出细菌视紫红质在细胞膜上有规律地排列和定向排列的结论。然后，基于AronKlug等人提出的三维重建技术，Henderson和他的同事获得了细菌视紫红质的粗略三维结构图像。这也是历史上第一个膜蛋白领域的三维结构。

这张图像的分辨率达到了7埃(相当于0.7纳米)，是当时电子显微镜获得的最好的蛋白质图像。但亨德森的目标是达到约3埃的分辨率，这大致相当于以前的X射线晶体成像。

15年后的1990年，亨德森再次发布了具有原子分辨率的细菌视紫红质三维图像，证明了电子显微镜生物分子成像的潜力。

如果说亨德森坚定地选择了生物大分子高分辨率观测的道路，那么约阿希姆弗兰克就是冷冻电镜单粒子分析的鼻祖，他用了十几年的时间完成了单粒子的三维重建算法和软件Spider。同样是在1975年，JoachimFrank开始思考如何对电子显微镜获得的二维平面模糊图像进行分析叠加，最终得到分辨率更高的三维图像。

1981年，Frank完成了一种算法，通过计算机识别图像采集同一蛋白质的不同阴影，对轮廓相似的图像进行分类对比。通过分析不同的重复模式，这些图像被拟合成更清晰的2D图像。在此基础上，通过数学方法，建立同一蛋白质的不同2D图像之间的关系，并在此基础上拟合出三维结构图像。弗兰克的图形拟合程序被认为是冷冻电子显微镜发展的基础。

JacquesDubochet的重要贡献是在true 空环境中保持生物分子的自然形状。几乎与此同时，1978年，迪波什开始解决电子显微镜领域的样品干涸和被破坏的问题。如前所述，Henderson在细菌视紫红质成像中使用葡萄糖保护样本，但这种方法并不普遍适用。

德波什的方法是玻璃化生物样本。一般来说，通过氢键的相互作用，水分子会形成有序排列，在凝固过程中形成晶体。迪波什想的是让水分子在相互作用之前凝固。将生物样品浸泡在预先用液氮冷却的乙烷中，可以使水迅速冷却，在几毫秒内完全凝固。这样就不是晶体而是非晶态，玻璃也是非晶态，故名玻璃化。生物样本镶嵌在无定形的冰中，可以称之为真实的瞬间。

1982年，Debosh开发了一种真正成熟可用的快速冷冻样品制备技术，可以在不形成冰晶的情况下制作玻璃状覆冰样品。1984年，Debosh首次发布了不同病毒的结构图像。

到目前为止，用电子显微镜观察生物大分子的元素还是比较容易的。

当然，冷冻电镜时代的真正到来，还得益于诸多技术的进步，比如样品制备技术、新一代电子探测器的发明、软件算法的优化等。2013年，加州大学三藩市分校(UCSF)的程一帆和DavidJulius研究组首次用冷冻电镜获得了膜蛋白TRPV1的3.4埃高分辨率三维结构，被视为一个里程碑。

国内对诺贝尔奖得主助理的热情

从2013年开始，冷冻电镜成为许多诺贝尔奖级论文的有力助手。在国内，中科院院士、结构生物学家、清华大学副校长石是这一领域的领军人物，他对剪切复合体的研究基本使用的是冷冻电镜技术。

20世纪90年代中期，清华大学隋森方院士、中山大学张景强教授和中国科学院生物物理研究所许巍研究员开始研究冷冻电镜。真正的布局是在2010年之前，那时冷冻显微镜已经蓄势待发。

2009年8月25日上午，清华大学医学研究所与费电子显微镜合作签约仪式暨亚洲首台KRIOS冷冻显微镜落成仪式在医学部大楼举行。时任生命科学与医学研究院副院长的石在合作协议上签字。FEITITAN KRIOS 300 kV透射电镜是世界上最先进的高分辨率场发射冷冻透射电镜，当时全球安装不超过10台。

随后，北京大学医学部和中国科学院生物物理研究所也购买了冷冻电镜。2017年5月，浙江大学自筹资金6000万元成立了冷冻电镜中心，成为世界上设备最齐全、技术覆盖面最广的冷冻电镜中心之一。

出席浙江大学冷冻电镜中心成立仪式的史当时说，冷冻电镜的发展就像一场暴力革命。"就目前的发展前景来看，冷冻电镜是可以和测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术！"

好在在业界看来，中国在冷冻电镜的应用上并不落后。