冷冻电镜工作原理是怎样的？(冷冻电镜介绍)

说到冷冻电子显微镜，全称是冷冻电子显微镜(cryoelectron microscope)。简单来说，就是通过电子显微镜观察冷冻的固体样品，然后得到清晰的三维结构。该技术可以清晰地观察液体、半液体以及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等

1.什么是冷冻电子显微镜技术？

冷冻电子显微镜技术也称冷冻电子显微镜技术，是一种利用透射电子显微镜在低温下观察样品的显微技术，即将样品冷冻并低温保存，放入显微镜中，以高相干电子为光源，从上方照射，通过样品及附近冰层散射。我们用探测器和透镜系统记录散射信号，最后对信号进行处理得到样品的结构。作为结构生物学的重要研究手段，冷冻电镜与X射线晶体学和核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。这项技术获得了2017年诺贝尔化学奖。获奖原因是"冷冻电子显微镜(也称为低温电子显微镜)被开发用于确定溶液中生物分子的高分辨率结构"，简化了生物细胞的成像过程，提高了成像质量。

2.冷冻电子显微镜的成像原理。

在光学显微镜下，穿过标本的可见光会通过光学透镜折射形成图像。电子显微镜和光学显微镜的成像原理基本相同，不同的是电子显微镜采用电子束作为光源，80-300kV电子束加速电压和电磁场作为透镜。两者的主要区别是分辨率的不同，而影响分辨率的直接因素是光源的波长，即波长越短，分辨率越高。光子的波长约为500纳米。电子的波长大约是光子波长的百分之一。1975年，亨德森首次通过电子显微镜以0.7nm的分辨率分析了细菌视紫红质的结构。这些开创性的研究最终确定了细菌视紫红质和其他膜蛋白(如水通道蛋白)的近原子分辨率图谱。这些研究为许多二十面体病毒的原子分辨率模型的生成奠定了基础。非有机样品的分辨率更高，其成像时的电子剂量远高于生物材料，且结构完整。

那么，为什么不能在原子分辨率的电子显微镜下直接成像单个蛋白质、病毒、细胞的自然状态呢？

在传统的透射电镜下，一般采用负染法来减少损伤，即在可及分子的表面涂上一层含有重原子的试剂，如醋酸铀酰，这种试剂的辐射灵敏度远低于有机物。通常形成的细胞、病毒和蛋白质图像的分辨率为2-4nm。未染色样品高分辨率成像的难点在于，降低的电子剂量为了使损伤最小化，会产生噪声图像，当电子剂量足够高以获得良好的信噪比时，样品损伤会达到不可接受的程度。

为了解决上述问题，在冷冻电子显微镜中使用了以下两种方法。第一种方法是使用保存在液氮或液氦温度下的冷冻标本进行成像。近40年来，对室温衍射强度和低温衍射强度衰减的测量表明，低温电子显微镜可以降低辐射损伤的影响。采用在一层玻璃冰中快速冷冻(玻璃化)生物样品，然后在液氮或氦的温度下成像的方法，使低温电子显微镜技术得到广泛应用。向液氮冷却的乙烷等冷冻液体中注入水溶液是一种制备冷冻电镜样品的方法，用于色谱成像、单粒子成像以及螺旋和二维晶体。与室温相比，在液氮温度下成像可将辐射损伤降低高达6倍。这意味着单位电子剂量的辐射损伤减少，对于低温下记录的图像，可以使用更高的电子剂量来提高信噪比。事实上，液氮和液氦都已经成功用于近原子分辨率的三维重建，在它们的冷却下分辨率可以达到0.4到2nm左右。提高信噪比的第二种方法是对同一生物样本单元的大量图像进行平均。该技术首先应用于螺旋组装体和二维蛋白质晶体的室温成像和低温成像。这两个概念，即低温成像的概念和多个低剂量图像平均的概念，构成了现代高分辨率生物电子显微镜的基础。

3.冷冻电子断层成像技术

电子层析成像(ECT)通过采集同一区域多个角度的投影图像，重建被研究对象的三维结构，适用于研究纳米尺度上无结构均匀性的蛋白质、病毒、细胞器及其复合物的三维结构。虽然电子层析获得的结构分辨率约为4 ~ 10 nm，但它在研究无定形、不对称、非各向同性的生物样品的三维结构和功能方面具有不可替代的作用。冷冻电子断层成像的适用范围非常广，包括分子水平的蛋白质、亚细胞水平的细胞器和细胞水平的组织结构。有效填补了X射线晶体学、核磁共振、冷冻电镜单颗粒分析获得的高精度结构与光学显微镜技术获得的低分辨率全细胞图像之间的空 white的空白。

4.冷冻电子显微镜的单粒子技术

冷冻电镜单粒子技术利用二维投影图像的大量数据，将蛋白质复合物不同方向的相同拷贝组合起来，重建三维结构。像大多数其他低温电子显微镜应用一样，单粒子成像的第一步是将可溶性复合物扩散到碳膜的孔隙上。然后标本被活塞冷冻，形成一层薄薄的玻璃状冰。理想情况下，这层冰层包含不同方向的化合物的相同副本。冰层的厚度可以从几百埃到几千埃不等，这受到颗粒大小和缓冲区成分的影响。从包含许多分子复合物的场的图像开始，通过手动或自动算法选择单个粒子。一旦选择了一种统计方法，如主成分分析、多元分析或协方差分析，就可以根据图像结构特征的变化对图像进行排序。从分子复合体的二维电子显微镜投影图生成三维重建依赖于所有粒子的相对取向。涉及的步骤数学上比较复杂，使用了中心投影定理，指出对于一个三维物体，每个二维投影的傅里叶变换都是物体三维傅里叶变换得到的中心切片(图5)。因此，通过获得包含相对于电子束的各种方向的足够大数量的分子图像，可以建立3D图像(如图6所示，使用显示2D图像的不同取向的GroEL来获得其三维结构)。

5.低温电子显微镜技术的突破

近年来，冷冻电镜技术的突破主要体现在三个方面。首先是样品制备。通过使用薄膜碳层甚至石墨烯，可以用更薄的冰层包裹分子样品，提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，即电子探测器的发明。在300keV电子的轰击下，传统器件会被高能损坏。因此，在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子变成光信号，再通过CCD将光信号转换成电信号，从而获得图像。"电光-光电"转换过程会降低信噪比。现在电子探测器可以直接检测电子的数量。同时，互补金属氧化物半导体(CMOS)光敏元件的应用，使得探测器支持moviemode，一秒钟可以获得几十个投影画面。通过后期对样本的漂移校正，将这几十张图片叠加起来，大大提高了成像的信噪比。模糊的图像突然变得清晰，冷冻电子显微镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力和软件算法的提升。冷冻电镜的模型重建通常需要对数万甚至数十万张投影图进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源和有效的算法来实现。综上所述，冷冻电镜不仅提高了空的分辨率，还可以用来研究很多以前无法解决的生物大分子的结构。